以下實驗方案介紹了貼壁培養(yǎng)哺乳動物細胞傳代的一般流程。請注意昆蟲細胞與哺乳動物細胞傳代的一些關鍵步驟有所不同。更多信息請參閱下一頁的“昆蟲細胞傳代的注意事項”部分。
為自己所用的細胞系傳代時，建議您嚴格遵守實驗中所有產品附帶的操作說明。偏離某種細胞所需的培養(yǎng)條件會導致細胞表型異常，甚至培養(yǎng)*失敗。
所需材料 ：裝有貼壁細胞的培養(yǎng)容器
：經過組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
：*生長培養(yǎng)基，預熱至37℃
：一次性無菌15-ml試管
：37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣
：平衡鹽溶液，例如：杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（DPBS），不含鈣、鎂和酚紅
：解離劑，例如：胰蛋白酶或TRYPLE™EXPRESS,不含酚紅
：用于活細胞和總細胞計數(shù)的試劑和設備，例如：countess™||自動細胞計數(shù)儀、臺盼藍染料或血球計數(shù)器。
貼壁細胞傳代流程 所有與細胞接觸的溶液和設備均為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術，并且在層流通風櫥內工作。
- 從培養(yǎng)容器中吸出用過的細胞培養(yǎng)基并丟棄
- 用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液沖洗細胞（每10cm 2)培養(yǎng)表面面積需要2ml溶液）。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數(shù)次。
注：沖洗步驟可去除可能抑制解離劑作用的少量血清、鈣和鎂。
- 從培養(yǎng)器中吸出沖洗液并丟棄。
- 向培養(yǎng)瓶中加入預熱的解離劑（例如：胰蛋白酶或tryple™）；試劑量應足以覆蓋細胞層（每10cm2大約0.5ml）。輕輕搖晃容器，使試劑*覆蓋細胞層。
- 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約2分鐘。請注意實際孵育時間根據(jù)所用細胞系不同而有所差異。
- 在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90％，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況，也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細胞解離。
- 細胞解離程度大于90％時，傾斜培養(yǎng)容器，使細胞上液體盡快流盡。加入所用解離劑兩倍體積的預熱*生長培養(yǎng)基。吹打細胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。
- 將細胞轉移到15-ml錐形管中，以200×g的離心力離心5至10分鐘。請注意離心速度和時間依細胞種類不同有所差異。
- 用少體積的預熱*生長培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀，取出少量樣品進行計數(shù)。
- 采用血球計數(shù)器、細胞計數(shù)儀按照臺盼藍拒染法或者使用countess™||自動細胞計數(shù)儀測定總細胞數(shù)和活細胞百分比。必要時，可再次向細胞中加入生長培養(yǎng)基，以便達到所需的細胞溶度，并重新進行計數(shù)。
注：我們建議使用countess™||自動細胞計數(shù)儀測定細胞數(shù)和活細胞百分比。Countess™||自動細胞計數(shù)儀計數(shù)所需的樣本量與您目前使用的血球計數(shù)器所需量相同，且不到10秒鐘即可完成一個樣本的典型細胞計數(shù)，適用于各種真核細胞。
11：將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細胞懸液轉移到新的細胞培養(yǎng)容器中，把細胞放回培養(yǎng)箱。
注：如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通風式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋。
貼壁昆蟲細胞傳代的注意事項
雖然昆蟲細胞傳代的一般步驟與哺乳動物細胞相同，但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關鍵要求有所不同。為了獲得滿意結果，實驗中必須嚴格遵守所有產品附帶的操作說明。
- 昆蟲細胞應在對數(shù)期傳代。但是，如果培養(yǎng)的是強貼壁性昆蟲細胞，則應在細胞達到匯合狀態(tài)或者剛剛開始從培養(yǎng)瓶底部脫離時進行傳代，因為此時細胞容易脫離。
- 細胞密度低于匯合狀態(tài)的20％時，細胞生長會受到抑制。健康狀態(tài)的細胞是對數(shù)期收獲的細胞。
- 培養(yǎng)昆蟲細胞時建議不要二氧化碳交換。
- 昆蟲細胞應于27℃、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)。在避光條件下可將細胞放在操作臺上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng)。但是，建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境。
- 使用昆蟲細胞的培養(yǎng)基。
- 在無血清培養(yǎng)條件下，昆蟲細胞與基質貼附極為牢固，需要花費較大力氣才能使其脫落。要使細胞脫落，可以采用拍掌的動作快速振搖一下培養(yǎng)瓶。為了避免污染，進行此操作前必須蓋緊蓋子。
警告：建議不要劇烈搖晃培養(yǎng)瓶，因為這樣可能會造成細胞損傷。
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