細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒

清洗

在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學物質，均能影響培養(yǎng)細胞的生長。因此對新使用玻璃器 皿和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴格*的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同 的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

組織細胞培養(yǎng)中，使用量大的是玻璃器皿，故工作大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質。

（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被 溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。再次使用的玻璃器皿則常附有 大量剛使用過的蛋白質，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求*浸入，不 能留有氣泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的 雜質。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。

（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。清 潔液去污能力很強。是清洗過程中關鍵的一環(huán)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器 皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應少于 6 小時。 清潔液可根據(jù)需要，配制成 不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）（A）強 清潔液 63∶1000∶200000（B）次強清洗液 120∶200∶1000（C）弱清潔液 100∶100∶100。

清潔液配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒 攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。

（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，用蒸餾水清洗 3-5 次，晾干備用。

膠塞的清洗

細胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先 用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質。自來水沖洗后，再用 1% 稀 鹽酸浸泡 30 分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸 10-20 分鐘，晾干備用。

塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用 2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用 5% 鹽酸溶液浸泡 30 分鐘， 后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

消毒

細胞培養(yǎng)的大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是 由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不*。由于有關培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。 消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學滅菌法（各種化 學消毒劑）和抗生素。

（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線 直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養(yǎng)室紫外 線燈應距地面不超過 2.5 米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作 用。紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不 宜近照射。

（2）溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用廣泛、效果接近的消毒方法。溫熱消毒時， 消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通。 在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣 閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。 消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事 件發(fā)生。

常用物品消毒壓力及時間：

培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃, 15 磅, 20 分鐘；

布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先 121℃, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；

玻璃瓶：干熱滅菌 170℃, 4 小時。

（3）化學消毒法：常見的是 70% 酒精及 1‰ 的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚， 操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消 毒?；瘜W消毒法操作簡單、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染。

細胞培養(yǎng)常用物品

細胞培養(yǎng)基

目前，市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質量不易控制。液體培養(yǎng)基是由專業(yè)產(chǎn)家按標準規(guī)模化生產(chǎn)，不僅質量得到保證，而且使用十分方便。

血清（略）

平衡鹽液體

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）標準型

Hanks’ 平衡鹽溶液（Hanks’ Balanced Salt Solutions，HBSS）

D-Hanks’ 平衡鹽溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)

消化液：

分離組織和分散細胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉 (EDTA) 兩種溶液?？梢?單獨使用，也可以混合使用。

（1）胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是一種黃白色粉末，易潮解，應放置冷暗干燥處保存。目前應用的胰蛋白酶主要來自牛或豬的胰腺。胰酶的主要作用是使細胞間的蛋白質水解，使細胞相 互離散。胰酶對細胞的分離作用與細胞的種類和細胞的特性有密切關系。一般來講，胰酶濃度大、作用溫度高、作用時間長，對細胞分離能力也大，但超過一定的限度會損傷細胞。胰 酶溶液在 pH8.0，溫度為 37℃ 時，作用能力。注意：鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用無 Ca2+、Mg2+的 D-Hanks』 平衡鹽溶液配制成 0.25% 溶液。消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對 細胞的消化作用。

胰蛋白酶溶液配制：

（1）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許 D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調(diào)成糊狀， 然后再補足 D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫 4 小時或冰箱過夜，并不斷攪拌振蕩；

（2）次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫Ｓ脻舛?為 0.25% 或 0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào) pH 至 7.2 左右。

保存條件：配制好的胰蛋白酶溶液必須保存在-20℃ 冰箱中，以免分解失效。

EDTA•4Na 溶液

EDTA 是一種化學螯合劑，對細胞有一定的離觧作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便。 常用工作液濃度為 0.02%。通常與 0.25% 的胰蛋白酶溶液按 1：1 混合使用（混合液）。

注意：使用 EDTA 處理細胞后，一定要用 Hanks 液沖洗干凈，因殘留的 EDTA 會影響

細胞生長。

EDTA 溶液配制：用無鈣、鎂的 D-HBSS 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶， 室溫或 4℃ 冰箱保存。

胰蛋白酶–EDTA•4Na 溶液（0.05% 胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA•4Na）

0.5 g 胰蛋白酶＋0.2 gEDTA•4Na＋1L D-HBSS。-20℃ 冰箱中保存。

pH 調(diào)整液

（1）NaHCO3 溶液

常用濃度為 7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌，分裝，4℃ 冰箱或室溫保存。 當 pH 值超過后，可用高壓滅菌的 10％ 醋酸溶液或通入 CO2 氣體方法調(diào)節(jié)。

（2）HEPES（分子量 238.31）溶液

HEPES 使用終濃度一般為 10-50 mM, 但通常配成 1M 儲存液：用 200 ml 雙蒸水溶解 47.6 克 HEPES，用 1N NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.5-8.0; 然后過濾除菌，分裝小瓶，室溫或 4℃ 保存。 抗生素溶液

酚紅：

大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為 pH 指示劑。紅色表示中性 pH，黃色代表酸性 pH，紫色表 示堿性 pH。但是，在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅，因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用。

丙酮酸鈉：

是細胞液中細胞的另一種碳源。D-葡萄糖是細胞優(yōu)選碳源，但是當培養(yǎng)液中 D-葡萄糖耗 盡時，細胞可以代謝丙酮酸鈉獲取碳源。

抗生素

哺乳動物細胞冷凍保存

主要目的：（1）保存種子細胞，以便隨時取用。這是保存細胞的主要目的。

（2）減少細胞被微生物污染的危險性。

（3）減少細胞之間交叉污染的危險性。

（4）減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。

（5）避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉化。

(6) 降低人力和物力。

冷凍保存要點：（1）冷凍過程要緩慢。需要冷凍保存的細胞先在 4℃ 冰箱中放置 30－60 分鐘；然后轉入-20℃，放置 30 分鐘；然后再轉入-80℃ 放置 16－18 小時（或過夜）；后放入液氮中長期保存。有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1 到 -3℃ 速度降溫，一直 到-80℃ 以下，然后直接放入液氮中長期保存。

（2）凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于 90％，無微生物污染。

（3）細胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用高濃度血清或蛋白保護劑。一般情況下，用于冷凍保存*細胞生長培養(yǎng)液中血 清濃度大于 20％。

（5）使用合適的細胞冷凍保護劑，以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，常用 的冷凍保護劑是 DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為 5－10％。但是，有些細胞系不能用 DMSO 作為冷凍保護劑，如人白血病細胞系 HL-60。因為，DMSO 能誘導 HL-60 細胞分化。在這種情 況下，可選用其它冷凍保護劑，如甘油（glycele）, 羥乙基淀粉等。

特別注意：（1）細胞在冷凍過程中在-20℃ 冰箱內(nèi)放置時間不可超過 1 小時，以防止冰 晶過大而破壞細胞。也可跳過-20℃ 這一步驟直接放入-80℃ 冰箱中，但這樣做細胞存活率要

低一些。

（2）DMSO 稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細胞液中，必須事先配制。

（3）DMSO 必須是細胞培養(yǎng)級別的。新買的 DMSO 本身處于無菌狀態(tài)，第1次開瓶后應 立即少量分裝于無菌試管或瓶中，4℃ 保存。避免反復凍融造成 DMSO 裂解產(chǎn)生有 害物質。并可減少污染機會。如要過濾 DMSO，必須選用耐 DMSO 的尼龍濾膜。

細胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護劑，基礎培養(yǎng)液，血清或蛋白。

常用細胞冷凍保存液：（1）10％DMSO ＋ *細胞生長培養(yǎng)液（20％ 血清＋基礎培養(yǎng)液）

（2）10％ 甘油 ＋ *細胞生長培養(yǎng)液（20％ 血清＋基礎培養(yǎng)液）懸浮細胞冷凍保存操作程序（液氮保存法）：

（1）取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)物，離心 200－400 g 5 分鐘。用粘附（貼壁）細胞冷凍保存操作程序（液氮保存法）：

冷凍保存細胞的解凍與復蘇要點：（1）快速解凍。凍存細胞從液氮中取出后，應立即放入37℃ 水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過 3 分鐘）。

（2）解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快， 而且動作要輕。一般情況下，解凍后的細胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)（1 ml 凍存細胞液加入到 25－30 ml 新鮮*培養(yǎng)液中），24 小時后再用新鮮*培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液，以去除 DMSO。如果，細胞對冷凍保護劑特別敏感，那么，解凍后 的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

特別注意：（1）解凍時務必注意安全，預防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，放入 37℃ 水浴中。切不可直接用手，以免凍傷。

（2）冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。

解凍冷凍保存細胞的離心方法:

(1) 從液氮中取出凍存的細胞，立即放入 37℃ 水浴中快速解凍。

（2）將 1－2 ml 凍存細胞液加入到 25 ml 新鮮*細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻。

（3）用 80 g 離心 2－3 分鐘，棄上清液。

（4）用*生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團，并計數(shù)細胞。

（5）接種細胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為 3×105/ml。